## 培养条件

**气相：** 采用95%空气与5%二氧化碳的混合气体。
**温度：** 37℃。

### 传代方法

首次建议采用1:2的传代比例。传代后2天需要更换培养液。如需做过渡对比培养，可用无菌离心管收集培养基。如果对比培养效果不佳，建议直接选择尊龙凯时的完全培养基进行购买，同时享受优惠。

当细胞收到后，应及时处理并培养至良好状态，然后用完全培养液灌满瓶口并封好，确保运输过程中的细胞健康。

### 消毒与静置

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶置入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后进行后续处理。

### 显微镜观察

在显微镜下观察细胞的生长情况，并分别以不同倍数拍照保存（建议40x、100x及200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，如果未提供照片，默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

1. **细胞传代：**

如果细胞汇合度未超过80%，请将瓶中完全培养液收集至离心管中，并保留5ml完全培养基，继续培养于37℃、5% CO2的孵箱中；若细胞密度超过80%，则可进行传代。

2. **贴壁细胞传代步骤：**

- 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
- 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml于培养瓶中，置于37℃的培养箱中消化1-2分钟。观察细胞状况，若大部分细胞变圆并开始脱落，迅速轻敲培养瓶并加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
- 轻轻吹打细胞，确保细胞完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
- 将细胞悬液按1:2的比例分至两个T25瓶中，并补充5-8ml的新完全培养基，最后将其放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

### 悬浮细胞传代步骤：

1. **半换液法：** 竖着放置培养瓶，静置1小时，轻吸去3ml培养基，然后补充3ml完全培养基；如培养基颜色变色慢可直接加500ul左右FBS。
2. **离心换液法：** 收集细胞悬液至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，添加1-2ml培养基重悬。根据实际情况将细胞悬液按1:2至1:5的比例分到新的培养瓶中，添加6-8ml按说明书配置的新完全培养基以保持细胞生长活力。

### 细胞冻存与复苏：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液并用PBS清洗。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞状态后加入5ml完全培养基终止消化，轻吹使细胞脱落，转移至离心管，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml尊龙凯时无血清冻存液，混匀后加入冻存管中，直接放入-80℃冰箱保存。
4. 复苏时，从液氮中取出冻存管，迅速置入37℃水浴解冻并消毒，离心后重悬细胞并接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

### 注意事项

有些细胞在运输过程中可能会脱落，这是正常现象。如脱离较多，需将培养液收集并进行离心处理，最后根据步骤重新传代。不管是初次培养还是后续操作，采用尊龙凯时的指导方针可有效保障细胞的健康与活力。