今天WB结果又偏离预期了！小李师弟盯着电脑，愁眉苦脸，处理完的条带灰度值与他之前的期望截然不同。为了完成这个实验，他已经忙碌了整整一周：处死小鼠、提取样品、定量、跑胶、转印、孵抗体、曝光，几乎杀了无数小鼠。他的项目是针对神经发育相关疾病的研究。在做Western实验之前，他特意查阅了相关文献，按照建议使用β-actin作为内参，但结果却令人震惊——P15小鼠的Akt蛋白结果与预期完全相反。明明神经元成熟时Akt应该下调，数据偏偏显示显著上升。

以β-actin作为内参的Akt表达随着小鼠的发育逐渐升高（趋势有误），而以总蛋白作为内参的Akt表达则随着小鼠的发育逐渐降低（趋势正确）。新研究表明，小鼠皮层发育的关键期（出生后10-15天）的β-actin和β-tubulin急剧下降30-40%，而GAPDH蛋白则激增100%。这些被认为是“管家”的蛋白，在神经发育的巨浪中自顧不暇，怎能作为稳定的锚点呢？

β-actin/β-tubulin：从“基建狂魔”变身为“维稳管家”，在P10后其表达量骤降，明显低于神经元迁移高峰期（P0-P5）的需求。相反，GAPDH在P10-P15期间突然提速（RNA同步上调16倍），与皮层髓鞘化和突触爆发的高能耗期完美契合。

全皮层均匀数据掩饰了细胞类型的急剧变化：在P0时神经元占比达到80%，而成年后胶质细胞激增至3倍。β-tubulin亚型Tubb2a在P25的27倍跌幅，恰恰印证了少突胶质细胞重塑微管网络的过程。单一内参无法捕捉这种“细胞合唱”的变化。

考虑到以上问题，推荐采用Total Protein总蛋白内参归一化方法，如丽春红、考马斯蓝、以及Stain-Free免染技术的创新：Stain-Free免染总蛋白技术通过紫外激发凝胶中的蛋白与预制染料结合，能够直接可视化胶及膜上的总蛋白，CV值小于10%的稳定性远超传统内参。此外，该技术无需染色、脱色操作。

操作指南：正常上样时，在凝胶或膜上选取全泳道的蛋白条带灰度值，从而彻底摆脱“单蛋白依赖”。在每次实验中附上总蛋白泳道的CV值（合格标准为小于10%）。跨发育阶段的实验必须进行内参稳定性预实验，如果不符合要求，就果断切换到总蛋白内参。可引用ENCODE转录组数据（GEO:ENCSR561OFW）进行交叉验证。本数据来自《Developmental Neuroscience》2025年的研究论文，DOI: 101159/000544064。

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