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尊龙凯时实时荧光定量PCR结果分析与常用名词解析

发布时间:2025-03-16   信息来源:尊龙凯时官方编辑

校正染料(ROX)在生物医学实验中用于校正加样误差及孔间误差,它提供了一个稳定的基线,大大提高了定量结果的精确度和重复实验之间数据的重现性。需要注意的是,不同仪器对ROX的需求有所不同。在基线PCR的最初几个循环中,荧光信号几乎没有变化,这样可以确保阈值在一个可信的最低荧光值。CT值是指扩增曲线与阈值交点的横坐标。

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二、结果有效性判断

通过单峰融解曲线(染料法)和扩增曲线中的指数扩增区域来评估结果的有效性。如果复孔间的CT值标准差(STD)小于0.2,表明阈值设置合理,并且该阈值应位于指数增长期。虽然仪器会自动计算阈值,但并非所有情况下这些计算都是合理的,因此在必要时需进行手动调整。

为了确认无气溶胶污染,可以进行无模板对照(NTC)测试,NTC表示在qPCR反应中,模板以水代替。如果ΔCT值(NTC的CT值减去目的基因的CT值)≥3或≥5,则可认为体系中不影响实验结果的准确性。同样,进行无逆转录对照(NRT)测试以确认无基因组残留,其中NRT是在逆转录反应中除逆转录酶外,其余组分正常添加的情况下。如果ΔCT值(NRT的CT值减去目的基因的CT值)≥3或≥5,认为基因组残留不会对实验结果产生影响。

待测CT值在扩增的线性范围内,且扩增效率达到近似计算标准时,PCR扩增效率(e)应当介于90%-120%之间。

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